IGF-1 LR3 Liofilizado

Elegir la cepa de expresión adecuada es crucial para la expresión de proteínas. Las cepas de expresión comúnmente utilizadas incluyen Rosetta (DE3), BL21 (DE3), etc. Estas cepas tienen sistemas eficientes de ARN polimerasa T7 y pueden expresar de manera eficiente genes impulsados ​​por el promotor T7.
Tomando como ejemplo Rosetta (DE3), entre sus características destacan: contener el gen de la ARN polimerasa T7, inducido por la expresión de IPTG. Portar genes de ARNt de codones raros puede expresar eficientemente genes exógenos que contienen codones raros. Adecuado para expresar proteínas tóxicas o proteínas difíciles de expresar.

Las condiciones de expresión de proteínas, como la concentración del inductor, la temperatura de inducción, el tiempo de inducción, etc., tienen un impacto significativo en el rendimiento y la calidad de las proteínas. Optimizando las condiciones de expresión, se puede aumentar el nivel de expresión de IGF-1 LR3.
Concentración del agente inductor: IPTG es un agente inductor de uso común, con una concentración típicamente entre 0,1 y 1 mM. Determine la concentración óptima de IPTG mediante experimentos de gradiente para lograr el nivel más alto de expresión de proteínas.
Temperatura de inducción: la temperatura de inducción generalmente se selecciona entre 16 y 37 grados. Las temperaturas más bajas (como entre 16 y 20 grados) pueden ayudar a reducir la degradación de las proteínas y la formación de cuerpos de inclusión, y aumentar la producción de proteínas solubles.
Tiempo de inducción: el tiempo de inducción suele ser de 2 a 24 horas, y el tiempo de inducción óptimo se determina analizando los niveles de expresión de proteínas mediante muestreo cronometrado.

la expresión deIGF-1 LR3 Liofilizadofue detectado mediante SDS-PAGE y métodos de transferencia Western.
SDS-PAGE: recolecte muestras bacterianas antes y después de la inducción, realice fragmentación ultrasónica o lisis química, centrifugue para separar el sobrenadante y el precipitado, y realice análisis SDS-PAGE por separado. Al comparar los cambios en las bandas de proteínas en el sobrenadante y el precipitado antes y después de la inducción, se confirmó la expresión de IGF-1 LR3.
Western blot: utilice anticuerpos específicos (como anticuerpos antietiqueta His o anticuerpos anti IGF-1) para realizar análisis de inmunotransferencia en proteínas separadas por SDS-PAGE para confirmar aún más la expresión y el peso molecular de IGF-1 LR3.

Recoger las células bacterianas inducidas y lisarlas para liberar proteínas intracelulares. Los métodos de craqueo comunes incluyen fragmentación ultrasónica, homogeneización a alta-presión, craqueo químico, etc. Tomando la fragmentación ultrasónica como ejemplo, los pasos son los siguientes:
Colección bacteriana: Centrifugar la solución bacteriana de expresión inducida para recolectar las células bacterianas y resuspenderlas en tampón de lisis (como PBS o tampón Tris HCl).
Fragmentación ultrasónica: la suspensión bacteriana se coloca en un baño de hielo y se tritura usando un disruptor ultrasónico, generalmente usando un método de fragmentación múltiple a corto plazo-(por ejemplo, 10 segundos cada vez, intervalo de 10 segundos, repetido 10 veces) para evitar la desnaturalización de proteínas debido al sobrecalentamiento.
Separación centrífuga: Centrifugar la suspensión bacteriana triturada para separar el sobrenadante y precipitar. El sobrenadante contiene proteínas solubles, mientras que el precipitado puede contener cuerpos de inclusión o restos celulares.

Debido al hecho de que el IGF-1 LR3 recombinante normalmente lleva una etiqueta His, se puede purificar mediante cromatografía de afinidad de iones de níquel (Ni NTA).
Preparación de la columna: Cargue el embalaje Ni NTA en la columna de cromatografía y equilibre con tampón de equilibrio (como PBS que contenga imidazol 20 mM).
Carga de muestra: cargue el sobrenadante del lisado bacteriano en la columna de cromatografía, permitiendo que el IGF-1 LR3 con etiqueta His se una a los iones de níquel.
Lavado: Lavar la columna de cromatografía con tampón de lavado (como PBS que contiene imidazol 50 mM) para eliminar las proteínas impurezas no unidas o débilmente unidas.
Elución: utilice un tampón de elución (como PBS que contenga imidazol 250 mM) para eluir el IGF-1 LR3 unido a la columna de cromatografía y recoger el eluyente.

La solución de IGF-1 LR3 después de la elución contiene una alta concentración de imidazol, que debe eliminarse mediante pasos de desalinización y concentración para aumentar la concentración de proteínas.

Desalinización: utilice una columna de desalinización o una bolsa de diálisis para eliminar el imidazol del eluyente y reemplácelo con una solución tampón adecuada (como PBS).
Concentración: Concentre la solución de proteína desalinizada utilizando tubos de ultrafiltración o concentradores centrífugos para aumentar la concentración de proteína al nivel deseado.

La pureza y actividad del IGF-1 LR3 purificado se detectaron mediante métodos SDS-PAGE, HPLC o ELISA.
SDS-PÁGINA: Analice la pureza de la proteína purificada y confirme que no haya bandas de impureza obvias.
HPLC: utilice HPLC de fase inversa o HPLC de exclusión por tamaño para analizar más a fondo la pureza y la distribución del peso molecular de las proteínas.
ELISA: El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se utiliza para detectar la actividad biológica del IGF-1 LR3, y su nivel de actividad se refleja en el grado de unión a anticuerpos específicos.